糖尿病足屬于糖尿病過程中的一種并發癥，其主要發病因素是由于糖尿病患者最先發生糖尿病周圍***變和糖尿病周圍血管病變等疾病，從而導致糖尿病患者足部組織的潰瘍甚至壞死，臨床癥狀主要表現為患者肢體麻木、疼痛、感覺異常等 [1] 。糖尿病足具有極高的致殘率和致死率，常導致患者截肢，目前糖尿病患者中約 25% 以上出現了糖尿病足及其相關疾病 [2] 。
按照中醫學辨證論治理論，根據糖尿病足的各時期的臨床癥狀，可歸屬于痹證（血痹、脈痹）、痛證、瘡瘍等范疇，發病多因飲食不節，膏粱厚味損傷脾胃，濕濁內生，痰凝經脈；或因氣虛血瘀，經脈痹阻，氣血不達四末，而致脈痹，病久肝腎虧虛，**消灼，致筋煉骨枯而成脫疽，在局部組織潰壞后易感外邪，從而導致創面難以愈合 [3-6] 。因此中醫治療常以活血化瘀和通脈止痛作為糖尿病足的主要治療方向。
糖痹外洗方由乳香、沒藥、辣椒、花椒、紅花、忍冬藤、冰片 7 味中藥組成，具有活血化瘀、通絡止痛等功效，能起到針對性治療糖尿病足以及相關疾病中痹癥、血痹、脈痹、痛證、瘡瘍的效果，臨床上已將糖痹外洗方作為治療糖尿病足的常用復方，具有很好的療效 [7-8] 。但目前對于其物質基礎及作用機制尚不明確。本研究立足于網絡藥理學方法 [9] ，結合 geo 數據庫進行基因芯片分析，對糖痹外洗方治療糖尿病足的物質基礎和作用機制進行初步探究，為后續深入研究糖痹外洗方治療糖尿病足的靶點及通路提供新的依據和思路。
1材料與方法
1.1糖痹外洗方活性成分收集及靶點篩選
采用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺 [10] （ tcmsp ， https://tcmsp-e.com/ ），以“乳香”“沒藥”“辣椒”“花椒”“紅花”“冰片”作為檢索關鍵詞進行檢索。對于 tcmsp 數據庫未收載的中藥忍冬藤則采用中醫藥整合藥理學研究平臺 [11] （ tcmip ， http://www.tcmip.cn/tcmip/index.php/home/）、中醫藥研究綜合數據庫[12] （ tcmid ， http://47.100.169. 139:8000/tcmid/search/ ）、本草組鑒數據庫 [13] （ herb ， http://herb.ac.cn/ ）查找其中所含化學成分，將忍冬藤查找到的化學成分在 tcmsp 數據庫中檢索，以獲得其對應的 mol id 和化合物詳細信息。根據 lipinski 的藥物分子類藥性“五規則” [14] ，對檢索到的各味藥中化合物進行篩選，由于糖痹外洗方為外用藥，可以忽略其口服利用度（ ob ）等因素的影響，因此采取藥物類藥性（ dl ）≥ 0.18 ，脂水分配系數 lgp ＜ 0.5 ，得到糖痹外洗方中 7 味中藥的候選活性成分。
1.2糖痹外洗方活性成分靶點篩選及網絡構建
在 tcmsp 、 tcmip 、 tcmid 和 herb 等數據庫中預測候選活性成分的靶點，同時結合 uniprot 數據庫 [15] （ https://www.uniprot.org/ ）對得到的靶點進行校正，得到對應的標準靶點基因名稱。將沒有對應靶點的候選活性成分去除，最后得到糖痹外洗方活性成分及對應靶點信息。利用 cytoscape 3.7.2 軟件 [16] 導入糖痹外洗方單味中藥名、候選活性成分、作用靶點信息，以此構建糖痹外洗方藥物 – 成分 – 靶點的網絡圖，同時利用 cytoscape 3.7.2 工具中的 network analyzer 插件對所有信息進行拓撲分析，從而根據度（ degree ）值的大小判別出網絡中的重要化合物。
1.3geo數據庫糖尿病足相關差異基因表達及靶點篩選
以“ diabetic foot ulcer ”“ diabetic peripheral ne**opathy ”“ diabetic peripheral vascular disease ”等與糖尿病足發生發展密切相關的疾病作為為關鍵詞，在 geo 數據庫 [17] 中檢索與其相關的基因芯片實驗信息。并與 home for researchers 平臺 [18] 對所查找到的基因芯片統一進行 log2 化處理。將從 geo 數據庫中篩選后得到的各芯片實驗的差異靶點進行合并，全部導入 excel 表格中并刪除重復靶標，從而得到糖尿病足以及其相關疾病的主要靶點。將復方的活性成分靶點與糖尿病足的相關靶點導入微生信（ http://www.bio****rmatics.com.cn/ ）在線作圖平臺取交集，獲得糖痹外洗方與糖尿病足的共同靶點。
1.4蛋白互相作用（ppi）網絡構建
將糖痹外洗方治療糖尿病足的靶點導入 string 11.5 數據庫 [19] （ https://www.string-db.org/ ）中，選擇 medium confidence （ 0.400 ）作為最小互作分數，對其進行 ppi 網絡分析，刪除孤立的蛋白，得到 ppi 數據并保存為 tsv 格式文件。將該網絡導入 cytoscape 3.7.2 中，利用 cytoscape 3.7.2 軟件構建 ppi 網絡進行可視化，并重新構建核心靶點的 ppi 網絡圖。
1.5共有基因基因本體（go）富集分析與京都基因與基因組百科全書（kegg）通路富集分析
為了進一步探究糖痹外洗方治療糖尿病足中參與的生物學過程、涉及的分子功能、成分以及信號通路等，將復方與疾病的交集靶點上傳至 metascape 在線 go 分析平臺 [20] （ http://metascape. org/ ），采用 metascape 對糖痹外洗方治療糖尿病足的作用靶點進行分析。將上述靶點導入分析平臺后，在輸入物種和分析物種 2 個選項中選擇“ h. sapiens (2) ”進行分析。最后得到 go 富集分析、 kegg 通路分析的結果，根據 lgp 值大小及靶點數目的多少對結果進行排序，設定 p ＜ 0.01 ，從中篩選出排名前 20 位的生物學過程和信號通路。同時，根據所屬通路將各靶點進行歸類，將信息導入 cytoscape 3.7.2 軟件中進行可視化處理，構建“通路 – 靶點”網絡圖。
1.6分子對接
通過分子對接對活性化合物和關鍵靶點的結合能力進行驗證。分子對接程序采用 autodock vina[21] ，對接方式選擇半柔性對接。各靶點的蛋白質晶體結構從 proteindata bank （ pdb ）數據庫 [22] （ http://www1.rc**.org/ ）下載，利用 discovery studio 4.5 client 將各蛋白的原配體與其蛋白分離，去除水分子后分開保存，使用 autodocktools 為各蛋白質結構加氫，保存為 pdbqt 格式用于下一步對接。從 tcmsp 數據庫下載用于對接的化合物結構，對接前使用 autodocktools 對蛋白質結構和預對接的化合物進行前處理，隨后使用 autodock vina 對接。統計各個化合物與蛋白最佳對接結果的結合自由能，并用 discovery studio 4.5 client 對結合自由能低的對接結果進行可視化。
2結果
2.1糖痹外洗方活性成分及靶點篩選結果
共得到乳香有效成分 5 個，沒藥有效成分 37 個，辣椒有效成分 8 個，紅花有效成分 35 個，花椒有效成分 6 個，忍冬藤有效成分 6 個，冰片有效成分 4 個，其中槲皮素為沒藥、紅花、花椒 3 味中藥的共有成分，共計有效成分 99 個。利用 uniprot 數據庫將所有活性成分的蛋白名稱轉化為基因名稱，得到乳香靶點基因 150 個、沒藥靶點基因 182 個、辣椒靶點基因 55 個、紅花靶點基因 229 個、花椒靶點基因 145 個、忍冬藤靶點基因 29 個、冰片靶點基因 51 個，對靶點基因整合去除重復值，得到活性成分對應的靶點基因 427 個，結果見表 1 、圖 1 。
2.2geo數據庫篩選糖尿病足差異基因表達結果
共查找到 4 個相關的基因芯片實驗，分別為 gse24290 、 gse43950 、 gse68183 、 gse80178 ，各芯片實驗差異基因表達結果如圖 1 所示。將從 geo 數據庫中篩選得到的各芯片實驗的差異靶點進行合并，全部導入 excel 表格中并刪除重復靶標，從而得到糖尿病足及其相關疾病主要靶點共 2 217 個。將復方的活性成分靶點與糖尿病足的相關靶點在線作圖平臺取交集，獲得糖痹外洗方與糖尿病足的共同靶點 64 個，見圖 2 。
2.3糖痹外洗方足與糖尿病**集靶點ppi網絡
將上述糖痹外洗方治療糖尿病足的64個靶點導入string數據庫，對糖痹外洗方治療糖尿病足的潛在作用靶點進行ppi分析，將置信度設置為＞0.400，剔除孤立的靶點蛋白，獲取蛋白互作信息；導入cytoscape 3.7.2軟件中進行可視化處理及網絡拓撲學分析，得到糖痹外洗方治療糖尿病足的相關靶點的ppi，該網絡由59個節點、256條邊組成，見圖3。根據ppi網絡圖可知，核心靶點主要有腫瘤蛋白p53（tp53）、表皮生長因子受體（egfr）、趨化因子8（cxcl8）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（pparg）、環加氧酶2（ptgs2）、e1a結合蛋白p300（ep300）、細胞周期素d1（ccnd1）基因。
2.4go富集分析結果
使用matescape平臺對篩選出的64個交集靶點進行go分析，得到665個生物過程（bp）、30個細胞組分（cc）、80個分子功能（mf）。以benjamini校**和p＜0.01作為篩選條件，篩選出排名前20的條目進行可視化分析，見圖4。
go富集結果表明，糖痹外洗方治療糖尿病足的主要bp包括激素反應（response to hormone）、對細胞外刺激的反應（response to extracellular stimulus）、多肽反應（response to peptide）、對類固醇激素的反應（response to steroid hormone）、對糖皮質激素的反應（response to glococorticoid）。主要cc包括轉錄調節復合物（transcription regulator complex）、受體復合物（receptor complex）、核被膜（nuclear envelope）、膜微區（membrane microdomain）、脂筏（membrane raft），主要mf包括轉錄因子結合（transcription factor binding）、dna-結合轉錄因子結合（dna-binding transcription factor binding）、rna特異性聚合酶iidna-結合轉錄因子結合（rna polymerase ii-specific dna-binding transcription factor binding）、染色質結合（chromatin binding）、脂結合（lipid binding）。
2.5kegg通路富集分析結果
使用 matescape 平臺對篩選出的 64 個交集靶點進行分析，得到 kegg 通路富集分析共得到 100 條通路信息。以 benjamini 校**及 p ＜ 0.01 作為篩選條件，篩選出排名前 20 的條目進行可視化分析，見圖 5 。同時，根據所屬通路將各靶點進行歸類，將信息導入 cytoscape 3.7.2 軟件中進行可視化處理，并構建“通路 – 靶點”網絡圖，見圖 6 。
kegg 通路富集分析結果表明，糖痹外洗方治療糖尿病足的主要作用通路包括：癌癥通路（ pathways in cancer ）、脂質與動脈粥樣硬化通路（ lipid and atherosclerosis ）、 janus 激酶 – 信號傳導及轉錄激活因子 1 信號通路（ jak-stat signaling pathway ）、磷脂酰肌醇 -3- 羥激酶（ pi3k ） – 蛋白激酶 b （ akt ）信號通路（ pi3k-akt signaling pathway ）、糖尿病并發癥晚期糖基化終末產物 /ages 受體（ age-rage ）信號通路（ age-rage signaling pathway in diabetic complications ）、 p53 信號通路（ p53 signaling pathway ）、核因子 -κb （ nf-κb ）通路（ nf-kappa b signaling pathway ）、 egfr 酪氨酸激酶***抵抗通路（ egfr tyrosine kinase inhibitor resistance ）等。其中脂質與動脈粥樣硬化通路和 jak-stat 信號通路詳細信息見圖 7 。
2.6分子對接結果
由 ppi 網絡及通路分析結果可以看出， egfr 、 pparg 、 ptgs2 、 jak2 、 mmp1 等屬于不同類型或通路的靶點在糖痹外洗方治療糖尿病足的過程中扮演著重要的作用，因此，選取以上幾個蛋白作為分子對接目標靶點。根據化合物的度值選取靠前的 10 個主要化合物，包括槲皮素（ quercetin ）、大豆苷元（ daidzein ）、辣椒堿（ capsaicin ）、山柰酚（ kaempferol ）、木犀草素（ luteolin ）、楊梅素（ myricetin ）、積雪草酸（ asiatic acid ）、鞣花酸（ ellagic acid ）、松柏苷（ coniferin ）、地奧司明（ diosmin ），分別與 egfr （ pdb id:4hjo ）、 jak2 （ pdb id:5aep ）、 mmp1 （ pdb id:1hfc ）、 pparg （ pdb id:7awc ）、 ptgs2 （ pdb id:5ikt ）進行分子對接驗證，以 pdb 官網下載文件中各靶點蛋白自帶配 體作為對照。目前普遍認為，化合物與蛋白結合自由能越低，說明二者之間結合越穩定，而結合能 ＜ ? 5.0 kcal/mol （ 1 cal ＝ 4.4 j ）表明化合物與靶點結合情況較好 [23] ，因此使用結合自由能大小來預測各化合物與蛋白作用情況，各化合物與蛋白對接后結合自由能結果見圖 8 。使用 discovery studio 2016 client 對靶點與化合物對接結合自由能低的結果進行可視化，見圖 9 。
3討論
本研究以網絡藥理學為基礎，在 tcmsp 、 tcmip 、 tcmid 、 herb 等數據庫中檢索并得到糖痹外洗方的活性成分和對應靶點，結合 geo 數據庫對糖尿病相關基因芯片實驗結果進行總結，得到 4 個與糖尿病足相關疾病基因芯片實驗中的差異表達基因，將化合物對應靶點和疾病靶點取交集，最終得到復方治療糖尿病足的相關靶點，對交集靶點進行 ppi 分析，初步得到了糖痹外洗方治療糖尿病足過程中的主要物質基礎和可能的分子機制，并通過對糖痹外洗方和糖尿病足的交集靶點進行 go 富集分析和 kegg 通路分析，得到其治療過程中可能 涉及的 bp 、 cc 、 mf 、作用通路等信息。根據 kegg 通路分析結果可知，糖痹外洗方主要作用于脂質與動脈粥樣硬化通路、 jak-stat 信號通路、 pi3k-akt 信號通路、糖尿病并發癥 age-rage 信號通路、 nf-κb 通路等。
持續高血糖會導致糖尿病患者體內多種蛋白質非酶糖基化從而形成晚期糖基化終末產物（ages），ages屬于age-rage信號通路中的核心因子，它的產生會激活age-rage信號通路[24]，并進一步激活nf-κb、血管內皮生長因子（vegf）等信號通路，進而引起大量炎癥因子和活性氧（ros）的釋放、血管通透性的增加，造成糖尿病足創面形成和難愈[25]，而機體中活性氧的增加會激活jak-stat信號通路，可以在一定程度上降低炎癥反應及氧化應激所導致的下肢神經炎癥和損傷[26]。有研究證明，pi3k-akt信號通路是影響胰島素信號通路中最重要的一條[27]，其可以通過抗胰島b細胞凋亡、促進胰島b細胞增殖以及減輕胰島素抵抗等一系列作用發揮其調控胰島b細胞的作用[28-29]。而在糖尿病足的發展進程中，首先會出現糖尿病下肢血管病變，其發生的機制與炎癥反應、血管內皮功能紊亂及胰島素抵抗等密切相關，在一定程度上屬于糖尿病合并下肢動脈粥樣硬化的范疇[30]，因此，動脈粥樣硬化所導致的動脈硬化狹窄、閉塞，下肢缺血缺氧，在糖尿病足的發生發展中起著至關重要的作用。
本實驗從糖痹外洗方7味中藥中選取不同類型的代表性核心化合物10個，以及5個在疾病發生發展中起著關鍵作用的靶點蛋白，其中核心候選活性成分包括槲皮素、大豆苷元、辣椒堿、山柰酚、木犀草素、楊梅素、積雪草酸、鞣花酸、松柏苷、地奧司明，其可能主要作用于egfr、pparg、ptgs2、jak2、mmp1等靶點。為了進一步探究各化合物與靶點作用情況，將此10個化合物分別與5個靶點蛋白進行分子對接初步驗證，結果顯示，除積雪草酸外，其它9個核心化合物與靶點蛋白對接后的結合自由能＜?5.0 kcal/mol，說明各化合物與靶點蛋白之間有較好的結合能力，而積雪草酸與pparg和mmp1對接后的結合結果較差，推測可能是由于pparg和mmp1活性空腔較小，而積雪草酸分子量較大，對接時位阻較大所致。從對接結果可以看出，地奧司明、鞣花酸、木犀草素、楊梅素、槲皮素等與egfr、jak2、mmp1對接后的結合自由能甚至等于或低于2個靶點蛋白原有的自帶配體，說明地奧司明、鞣花酸、木犀草素、楊梅素和槲皮素等可能對于糖尿病足有著很好的治療潛力，推測其主要作用于egfr、jak2、mmp1等相關的通路和靶點發揮作用。此外，10個核心化合物中，辣椒堿與pparg的結合自由能最低，地奧司明與ptgs2的結合自由能最低，推測辣椒堿和地奧司明能夠通過分別作用于與pparg和ptgs2相關的通路和靶點發揮治療糖尿病足的作用。
地奧司明常被用于增強靜脈張力和血管保護，可以降低靜脈血管血瘀滯，目前臨床已有報道將地奧司明用于治療糖尿病足，證明其能夠有效改善患者下肢水腫的癥狀，提高足部創口愈合率[31]，作用機制是減少機體中糖基化產物ages的產生[32]、激活jak-stat信號通路從而發揮抗炎抗氧化以及保護胰島b細胞的作用[33-34]。鞣花酸為天然多酚二內酯類化合物，具有很強的抗炎抗氧化作用[35]，有研究表明，其能夠通過抑制炎癥反應起到保護胰腺的作用[36]。在糖尿病微血管病變中，木犀草素能夠通過增強超氧化物歧化酶（sod）的活性，從而起到抗氧化的作用[37]。而楊梅素可以通過誘導胰島素的分泌、緩解高血糖導致的體內氧化等而具有顯著的降血糖作用，還可以降低一氧化氮（no）、腫瘤壞死因子-α（tnf-α）、白細胞介素（il）-1β、il-6等炎癥因子[38]，抑制tnf-α誘導的血管內皮生長因子vegf表達和皮膚組織中mmp-9的表達，從而發揮抗炎、預防皮膚和血管損傷的作用[39]。槲皮素為黃酮醇類化合物，對于氧化應激導致的神經損傷、細菌感染、炎癥反應具有良好的治療效果[40-42]，最近有研究發現，槲皮素還可通過保護胰島β細胞從而改善糖尿病大鼠的糖代謝水平[43]。
綜上所述，本研究以網絡藥理學為基礎，篩選出糖痹外洗方治療糖尿病足的核心藥效成分。糖痹外洗方中各成分主要通過降低血糖、抗炎、抗氧化、降低血瘀、促進血管生成和皮膚愈合等相關靶點及通路發揮作用，充分體現了復方多成分、多靶點的特點，其報道出的良好活性也與分子對接中所得出的結果相佐證，證明本研究網絡藥理學結果的可行性。本次結果得出的核心活性成分中也有許多尚未用于糖尿病足相關疾病的研究，后續可以在各化合物治療糖尿病足方面進行更加深入具體的研究。
利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突
參考文獻（略）
來 源：寧遵錫，劉鵬宇，楊宇，魏秀巖，高慧媛．基于網絡藥理學結合geo數據庫多芯片分析法探討糖痹外洗方治療糖尿病足的作用機制 [j]. 現代藥物與臨床, 2023, 37(9): 1975-1986 .
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